浅析中药清除羟自由基实验的改良
机体在代谢过程中产生多种自由基，包括超氧阴离子自由基（O-2·）、羟自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等，其中以·OH化学性质*活泼。一定数量的氧自由基可为机体所用，但过多的氧自由基将作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病［1～4］。因此，自由基清除剂的合成及寻找成为当前医药研究的主要方向之一，而中药的**、丰富及低毒更受人们的青睐。目前人们测定自由基清除剂清除羟自由基的方法有很多，其中邻二氮菲- Fe2+氧化法操作简单，设备要求不高，易于推广和应用。本实验对该方法进行了若干改良。
1 材料与方法
1.1 试剂维生素C（郑州羚锐制药有限公司生产）、邻二氮菲（天津市科密欧化学试剂有限公司生产，分析纯）、硫酸亚铁铵（广东光华化学厂有限公司生产，分析纯）、过氧化氢（广东汕头市西陇化工厂生产，分析纯）、磷酸二氢钾（上海市国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇和氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司生产，分析纯）。
1.2 仪器752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产），DK-600S三用恒温水浴箱（上海精密实验设备有限公司生产）。
1.3 方法以维生素C作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH。H2O2/Fe2+体系产生的·OH将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+对536 nm波长的*大吸收减弱，A536明显降低。当反应体系中存在·OH清除剂时，此氧化过程受抑制，A536则降低不明显，并可通过A536值比较·OH清除剂的清除能力［5］。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环境由pH 7.4改为pH 4.5的酸性环境；二是将37℃保温时间由60 min改为30 min；三是测定吸光度的波长由536 nm改为510 nm。实验过程中分别在pH 7.4的磷酸缓冲液及pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温5～60 min的时间范围内、536 nm和510 nm波长分别测定吸光度，比较两种pH条件下吸光度的差异。反应中依次加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素C、Fe2+及H2O2为加药管；不加维生素C为氧化管；不加维生素C及H2O2为对照管。
1.4 统计学处理组间采用t检验，数据以±s表示。
2 结果
2.1 不同测定波长及不同pH环境下的比较从表1可以看出，邻二氮菲-Fe2+络合物的*大吸收波长为510 nm，而*佳酸碱环境为pH 4.5。表1 不同测定波长及不同pH环境下的比较(略）
2.2 不同保温时间及不同pH环境下的比较图1显示了pH 7.4时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于15 min时达高峰，随后缓慢下降；而加药管和氧化管吸光度一开始便呈现急剧下降的趋势。图2显示了pH 4.5时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于30 min时达高峰，此后处于基本稳定状态；加药管和氧化管吸光度均于30 min后才出现较明显的下降。
2.3 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较从表2可以看出，随着保温时间的**，各管之间的ΔA逐渐加大，但pH 4.5时的ΔA加药管-氧化管，在30 min时*大，此后较为稳定。表2 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较（略）
3 讨论
实验表明，邻二氮菲-Fe2+络合物在酸性条件下（pH 4.5）比较稳定，有较高的吸光度，并且*大吸收波长为510nm。而保温时间也是实验中的一个重要环节，保温到某一时间时，各管的吸光度较大，同时各管之间的吸光度变化值（ΔA）也较大，有利于自由基清除剂的甑选。从实验中观察到，在pH 4.5的条件下，对照管保温到30 min有*大的吸收峰，加药管也有较大的吸光度，使加药管与氧化管之间ΔA（ΔA加药管-氧化管）达到*大，该值更能说明自由基清除剂的作用强弱，是判断自由基清除剂的重要指标，并且还能反映该方法的灵敏度。而在pH 7.4时，加药管和氧化管一开始便呈现急剧下降的趋势，虽然两管吸光度有所差异，但ΔA加药管-氧化管较pH 4.5时要小得多，不具有说服力，也降低了反应的灵敏度。综上所述，采用邻二氮菲- Fe2+氧化法衡量自由基清除剂的作用时，*佳反应条件为pH 4.5，测定波长为510 nm，37℃保温时间为30 min。
责任编辑：小季 WWW.1168.TV 2010-5-8 18:47:50
1 材料与方法
1.1 试剂维生素C（郑州羚锐制药有限公司生产）、邻二氮菲（天津市科密欧化学试剂有限公司生产，分析纯）、硫酸亚铁铵（广东光华化学厂有限公司生产，分析纯）、过氧化氢（广东汕头市西陇化工厂生产，分析纯）、磷酸二氢钾（上海市国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇和氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司生产，分析纯）。
1.2 仪器752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产），DK-600S三用恒温水浴箱（上海精密实验设备有限公司生产）。
1.3 方法以维生素C作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH。H2O2/Fe2+体系产生的·OH将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+对536 nm波长的*大吸收减弱，A536明显降低。当反应体系中存在·OH清除剂时，此氧化过程受抑制，A536则降低不明显，并可通过A536值比较·OH清除剂的清除能力［5］。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环境由pH 7.4改为pH 4.5的酸性环境；二是将37℃保温时间由60 min改为30 min；三是测定吸光度的波长由536 nm改为510 nm。实验过程中分别在pH 7.4的磷酸缓冲液及pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温5～60 min的时间范围内、536 nm和510 nm波长分别测定吸光度，比较两种pH条件下吸光度的差异。反应中依次加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素C、Fe2+及H2O2为加药管；不加维生素C为氧化管；不加维生素C及H2O2为对照管。
1.4 统计学处理组间采用t检验，数据以±s表示。
2 结果
2.1 不同测定波长及不同pH环境下的比较从表1可以看出，邻二氮菲-Fe2+络合物的*大吸收波长为510 nm，而*佳酸碱环境为pH 4.5。表1 不同测定波长及不同pH环境下的比较(略）
2.2 不同保温时间及不同pH环境下的比较图1显示了pH 7.4时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于15 min时达高峰，随后缓慢下降；而加药管和氧化管吸光度一开始便呈现急剧下降的趋势。图2显示了pH 4.5时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于30 min时达高峰，此后处于基本稳定状态；加药管和氧化管吸光度均于30 min后才出现较明显的下降。
2.3 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较从表2可以看出，随着保温时间的**，各管之间的ΔA逐渐加大，但pH 4.5时的ΔA加药管-氧化管，在30 min时*大，此后较为稳定。表2 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较（略）
3 讨论
实验表明，邻二氮菲-Fe2+络合物在酸性条件下（pH 4.5）比较稳定，有较高的吸光度，并且*大吸收波长为510nm。而保温时间也是实验中的一个重要环节，保温到某一时间时，各管的吸光度较大，同时各管之间的吸光度变化值（ΔA）也较大，有利于自由基清除剂的甑选。从实验中观察到，在pH 4.5的条件下，对照管保温到30 min有*大的吸收峰，加药管也有较大的吸光度，使加药管与氧化管之间ΔA（ΔA加药管-氧化管）达到*大，该值更能说明自由基清除剂的作用强弱，是判断自由基清除剂的重要指标，并且还能反映该方法的灵敏度。而在pH 7.4时，加药管和氧化管一开始便呈现急剧下降的趋势，虽然两管吸光度有所差异，但ΔA加药管-氧化管较pH 4.5时要小得多，不具有说服力，也降低了反应的灵敏度。综上所述，采用邻二氮菲- Fe2+氧化法衡量自由基清除剂的作用时，*佳反应条件为pH 4.5，测定波长为510 nm，37℃保温时间为30 min。
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